Зміїна отрута містить ферменти, які гідролізують карбоксильні ефірні зв'язки.Субстратами для гідролізу є фосфоліпіди, ацетилхолін і ароматичний ацетат.Ці ферменти включають три види: фосфоліпазу, ацетилхолінестеразу та ароматичну естеразу.Аргінінестераза в зміїній отруті також може гідролізувати синтетичний аргінін або лізин, але вона в основному гідролізує білкові пептидні зв’язки в природі, тому вона відноситься до протеаз.Обговорювані тут ферменти діють лише на складноефірні субстрати і не можуть діяти на будь-які пептидні зв’язки.Серед цих ферментів біологічні функції ацетилхолінестерази та фосфоліпази є більш важливими і повністю вивчені.Деякі зміїні отрути мають сильну ароматичну естеразну активність, яка може гідролізувати п-нітрофеніловий естер, a- або p-нафталіну ацетат та індол етиловий ефір.Досі невідомо, чи ця активність виробляється незалежним ферментом чи відомим побічним ефектом карбоксилестерази, не кажучи вже про її біологічне значення.Коли отрута Agkistrodon halys Japonicus реагувала з п-нітрофеніловим етиловим ефіром та індол-етиловим ефіром, гідролізати п-нітрофенолу та індолфенолу не були виявлені;Навпаки, якщо ці ефіри реагують зі зміїною отрутою підвиду кобри Чжоушань і зміїною отрутою Bungarus multicinctus, вони швидко гідролізуються.Відомо, що ці отрути кобри мають сильну активність холінестерази, яка може бути відповідальною за гідроліз вищезазначених субстратів.Насправді Маклін та ін.(1971) повідомили, що отрути багатьох змій, що належать до сімейства Cobra, можуть гідролізувати етиловий ефір індолу, етиловий ефір нафталіну та бутиловий ефір нафталіну.Ці зміїні отрути походять від: кобри, чорношиї кобри, чорногубої кобри, золотистої кобри, єгипетської кобри, королівської кобри, золотої кобри мамби, чорної мамби та білогубої мамби (D. aw все ще знає східну ромбоподібну гримучу змію
Зміїна отрута може гідролізувати метиліндол етиловий ефір, який є субстратом для визначення активності холінестерази в сироватці крові, але ця зміїна отрута не виявляє активності холінестерази.Це показує, що в отруті кобри є невідома естераза, яка відрізняється від холінестерази.Щоб зрозуміти природу цього ферменту, необхідна подальша робота по розділенню.
1, фосфоліпаза А2
(I) Огляд
Фосфоліпаза — це фермент, здатний гідролізувати гліцерилфосфат.У природі існує 5 видів фосфоліпази, а саме фосфоліпаза А2 і фосфоліпаза.
A. , фосфоліпаза B, фосфоліпаза C і фосфоліпаза D. Зміїна отрута в основному містить фосфоліпазу A2 (PLA2), деякі зміїні отрути містять фосфоліпазу B, а інші фосфоліпази в основному містяться в тканинах тварин і бактеріях.На рис. 3-11-4 показано місце дії цих фосфоліпаз на гідроліз субстрату.
Серед фосфоліпаз більше вивчена PLA2.Можливо, це найбільш вивчений фермент у зміїній отруті.Його субстратом є складноефірний зв'язок у другій позиції Sn-3-гліцерофосфату.Цей фермент широко міститься в зміїній отруті, бджолиній отруті, отруті скорпіона та тканинах тварин, а PLA2 міститься в отрутах чотирьох родин змій.Оскільки цей фермент розщеплює еритроцити і викликає гемоліз, його також називають «гемолізином».Деякі люди також називають PLA2 гемолітичною лецитиназою.
Ludeeke вперше виявив, що зміїна отрута може виробляти гемолітичну сполуку, впливаючи на лецитин через ферменти.Пізніше Delezenne та ін.довів, що при дії отрути кобри на сироватку або жовток коня утворюється гемолітична речовина.Зараз відомо, що PLA2 може безпосередньо впливати на фосфоліпіди мембрани еритроцитів, руйнуючи структуру мембрани еритроцитів і викликаючи прямий гемоліз;Він також може впливати на сироватку або доданий лецитин для утворення гемолітичного лецитину, який діє на еритроцити, викликаючи непрямий гемоліз.Незважаючи на те, що PLA2 є у великій кількості в чотирьох сімействах зміїних отрут, вміст ферментів у різних зміїних отрутах дещо відрізняється.Гримуча змія (C
Зміїна отрута показала лише слабку активність PLA2.Таблиця 3-11-11 ілюструє порівняння активності PLA2 10 основних отрут отруйних змій у Китаї.
Таблиця 3-11-11 Порівняння активності фосфоліпази VIII 10 зміїних отрут у Китаї
Зміїна отрута
Виділення жиру
Аліфатична кислота,
Кьюмоль/мг)
Гемолітична активність CHU50/^ г * мл)
Зміїна отрута
Вивільнення жирних кислот
(^raol/мг)
Гемолітична активність» (HU50/ftg * 1111)
Найджана атра
9. 62
одинадцять
Мікрацефаловий офіс
п'ять кома один нуль
калиспалас
8. 68
дві тисячі вісімсот
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Офіофаг Ханна
три кома вісім два
сто сорок
Bnugarus fasctatus
7,56
двісті вісімдесят
B. багатоочік
один кома дев'ять шість
двісті вісімдесят
Viper a Russelli
сім кома нуль три
T, mucrosquamatus
один кома вісім п'ять
сіаменсіс
T. stejnegeri
0. 97
（2） Розділення та очищення
Вміст PLA2 у зміїній отруті великий, і він стійкий до нагрівання, кислоти, лугу та денатуранта, тому його легко очистити та відокремити PLA2.Загальний метод полягає в тому, щоб спочатку провести гель-фільтрацію сирої отрути, потім провести іонообмінну хроматографію, і наступний крок можна повторити.Слід зазначити, що сублімаційна сушка PLA2 після іонообмінної хроматографії не повинна викликати агрегації, оскільки процес сублімаційної сушки часто збільшує іонну силу в системі, що є важливим фактором, що викликає агрегацію PLA2.Крім наведених вище загальних методів, також були прийняті такі методи: ① Wells et al.② Субстратний аналог PLA2 використовувався як ліганд для афінної хроматографії.Цей ліганд може зв'язуватися з PLA2 у зміїній отруті за допомогою Ca2+.EDTA в основному використовується як елюент.Після видалення Ca2+ спорідненість між PLA2 і лігандом зменшується, і його можна відокремити від ліганду.Інші використовують 30% органічний розчин або 6 моль/л сечовини як елюент.③ Було проведено гідрофобну хроматографію з PheiiylSephar0SeCL-4B для видалення слідів PLA2 у кардіотоксині.④ Антитіло до PLA2 використовували як ліганд для проведення афінної хроматографії на PLA2.
На даний момент очищено велику кількість зміїної отрути PLAZ.Ту та ін.(1977) перерахував PLA2, очищений від зміїної отрути до 1975 року. В останні роки щороку повідомлялося про велику кількість статей про виділення та очищення PLA2.Тут ми зосереджуємося на відділенні та очищенні PLA китайськими вченими.
Chen Yuancong та ін.(1981) відокремили три види PLA2 від отрути Agkistrodon halys Pallas у Чжецзяні, які можна розділити на кислі, нейтральні та лужні PLA2 відповідно до їх ізоелектричних точок.За своєю токсичністю більш токсичним є нейтральний PLA2, який був ідентифікований як пресинаптичний нейротоксин Agkistrodotoxin.Лужний PLA2 менш токсичний, а кислотний PLA2 майже не токсичний.Ву Сянфу та ін.(1984) порівняли характеристики трьох PLA2, включаючи молекулярну масу, амінокислотний склад, N-кінець, ізоелектричну точку, термічну стабільність, активність ферментів, токсичність і гемолітичну активність.Результати показали, що вони мали схожу молекулярну масу та термічну стабільність, але мали значні відмінності в інших аспектах.З точки зору активності ферментів кислотна активність ферменту була вищою, ніж лужна;Гемолітична дія лужного ферменту на еритроцити щурів була найсильнішою, за нею йшов нейтральний фермент, а кислотний фермент майже не гемолізувався.Тому існує припущення, що гемолітичний ефект PLAZ пов’язаний із зарядом молекули PLA2.Zhang Jingkang та ін.(1981) створили кристали Agkistrodotoxin.Tu Guangliang та ін.(1983) повідомили, що токсичний PLA з ізоелектричною точкою 7,6 був виділений і очищений з отрути Vipera rotundus з Фуцзянь, а його фізичні та хімічні властивості, амінокислотний склад і послідовність 22 амінокислотних залишків у N -термінали були визначені.Li Yuesheng та ін.(1985) виділив і очистив інший PLA2 з отрути Viper rotundus у Фуцзяні.Субодиниця PLA2 * становить 13 800, ізоелектрична точка становить 10,4, а питома активність становить 35/xnioI/miri мг。 З лецитином як субстратом оптимальний pH ферменту становить 8,0, а оптимальна температура становить 65 °C. LD5 вводять мишам внутрішньовенно.Це 0,5 ± 0,12 мг/кг.Цей фермент має явну антикоагулянтну та гемолітичну дію.Токсична молекула PLA2 складається з 123 залишків 18 видів амінокислот.Молекула багата цистеїном (14), аспарагіновою кислотою (14) і гліцином (12), але містить лише один метіонін, а його N-кінець є залишком серину.У порівнянні з PLA2, виділеним Tuguang, молекулярна маса та кількість амінокислотних залишків двох ізоферментів дуже подібні, а амінокислотний склад також дуже подібний, але кількість залишків аспарагінової кислоти та проліну дещо відрізняється.Отрута змії королівської кобри Гуансі містить багатий PLA2.Шу Юянь та ін.(1989) виділили з отрути PLA2, який має питому активність у 3,6 рази вища, ніж вихідна отрута, молекулярну масу 13000, склад із 122 амінокислотних залишків, ізоелектричну точку 8,9 і добру термостабільність.Під час електронного мікроскопічного спостереження за ефектом основного PLA2 на еритроцити видно, що він має очевидний вплив на мембрану еритроцитів людини, але не має явного впливу на еритроцити кози.Цей PLA2 має очевидний ефект сповільнення електрофоретичної швидкості еритроцитів у людей, кіз, кроликів і морських свинок.Чен та ін.Цей фермент може пригнічувати агрегацію тромбоцитів, спричинену АДФ, колагеном і арахідоновою кислотою натрію.Коли концентрація PLA2 становить 10/хг/мл~100 мкг/мл, агрегація тромбоцитів повністю пригнічується.Якщо в якості матеріалів використовували промиті тромбоцити, PLA2 не міг пригнічувати агрегацію в концентрації 20 мг/мл.Аспірин є інгібітором циклооксигенази, який може пригнічувати вплив PLA2 на тромбоцити.PLA2 може пригнічувати агрегацію тромбоцитів шляхом гідролізу арахідонової кислоти для синтезу тромбоксану A2.Конформацію розчину PLA2, утвореного отрутою Agkistrodon halys Pallas у провінції Чжецзян, вивчали за допомогою кругового дихроїзму, флуоресценції та ультрафіолетового поглинання.Експериментальні результати показали, що конформація головного ланцюга цього ферменту була подібна до конформації такого ж типу ферменту з інших видів і родів, конформація скелета мала гарну термостійкість, а структурні зміни в кислотному середовищі були оборотними.Комбінація активатора Са2+ і ферменту не впливає на середовище залишків триптофану, тоді як інгібітор Zn2+ діє навпаки.Спосіб, яким значення рН розчину впливає на активність ферменту, відрізняється від вищезазначених реагентів.
У процесі очищення PLA2 зміїної отрути очевидним явищем є те, що зміїна отрута містить два або більше піків виділення PLA2.Це явище можна пояснити наступним чином: ① через існування ізоферментів;② Один вид PLA2 полімеризується в різні суміші PLA2 з різною молекулярною масою, більшість з яких знаходиться в діапазоні 9 000–40 000;③ Комбінація PLA2 та інших компонентів зміїної отрути ускладнює PLA2;④ Оскільки амідний зв’язок у PLA2 гідролізується, заряд змінюється.① І ② є поширеними, лише за кількома винятками, наприклад PLA2 у CrWa/w зміїній отруті
Є дві ситуації: ① і ②.Третя умова виявлена в PLA2 в отруті таких змій: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, палестинська гадюка, піщана гадюка та жахлива гримуча змія km.
Результат випадку ④ змінює швидкість міграції PLA2 під час електрофорезу, але амінокислотний склад не змінюється.Пептиди можуть бути розщеплені шляхом гідролізу, але, як правило, вони все ще зв'язані між собою дисульфідними зв'язками.Отрута гримучої змії містить дві форми PLA2, які називаються PLA2 типу a та типу p відповідно.Різниця між цими двома типами PLA2 полягає лише в одній амінокислоті, тобто глутамін в одній молекулі PLA2 замінюється глутаміновою кислотою в іншій молекулі PLA2.Хоча точна причина цієї різниці не ясна, зазвичай вважають, що вона пов’язана з дезамінуванням PLA2.Якщо PLA2 в отруті палестинської гадюки підтримувати в теплі з неочищеною отрутою, кінцевих груп у його молекулах ферменту стане більше, ніж раніше.Із C PLA2, виділений із зміїної отрути, має два різних N-кінці, а його молекулярна маса становить 30 000. Це явище може бути спричинене асиметричним димером PLA2, який подібний до симетричного димера, утвореного PLA2 в отруті східної діамантової гримучої змії. і західна діамантова гримуча змія.Азіатська кобра складається з багатьох підвидів, деякі з яких не мають чіткої класифікації.Наприклад, тепер визнано те, що раніше називалося зовнішньокаспійським підвидом Cobra
Її слід віднести до зовнішньокаспійської кобри.Оскільки існує багато підвидів і вони змішані, склад зміїної отрути сильно відрізняється через різні джерела, а також високий вміст ізоферментів PLA2.Наприклад, отрута кобри
Принаймні 9 видів ізоферментів PLA2 видів r ^ ll виявлено в, а 7 видів ізоферментів PLA2 знайдено в отруті підвиду кобри каспійської.Durkin та ін.(1981) досліджували вміст PLA2 і кількість ізоферментів у різних отрутах змій, включаючи 18 отрут кобри, 3 отрути мамби, 5 отрут гадюк, 16 отрут гримучих змій і 3 отрути морських змій.Загалом активність PLA2 отрути кобри висока, з багатьма ізоферментами.Активність PLA2 та ізоферменти отрути гадюки середні.Активність PLA2 отрути мамби та гримучої змії є дуже низькою або взагалі відсутня.Активність PLA2 отрути морських змій також низька.
Останніми роками не повідомлялося, що PLA2 у зміїній отруті існує у формі активного димеру, наприклад у східної ромбофорної гримучої змії (C. зміїна отрута містить PLA2 типу a та типу P, обидва з яких складаються з двох ідентичних субодиниць , і тільки димераза має
діяльність.Shen та ін.також припустив, що тільки димер PLA2 зміїної отрути є активною формою ферменту.Дослідження просторової структури також доводить, що PLA2 західної діамантової гримучої змії існує у формі димеру.Рибоядная сполука
Існує два різних PLA ^ Ei та E2 зміїної отрути, в яких 仏 існує у формі димера, димер є активним, а його дисоційований мономер неактивний.Лу Інхуа та ін.(1980) далі вивчав фізичні та хімічні властивості та кінетику реакції E. Jayanthi та ін.(1989) виділив основний PLA2 (VRVPL-V) з отрути гадюки.Молекулярна маса мономера PLA2 становить 10000, який має летальний, антикоагулянтний і набряковий ефект.Фермент може полімеризувати полімери з різною молекулярною масою за умови PH 4,8, а ступінь полімеризації та молекулярна маса полімерів зростає з підвищенням температури.Молекулярна маса полімеру, утвореного при 96 ° C, становить 53 100, а активність PLA2 цього полімеру збільшується в два рази.
Час публікації: 18 листопада 2022 р